登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則附錄A：登革熱血清學(xué)檢測方法

A1 應(yīng)用IgM捕捉ELISA法檢測DFIgM抗體

AI.1原理

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，利用抗人謬鏈單克隆抗體捕獲待檢測血清中的IgM，再加入特異性抗原和相應(yīng)酶標(biāo)單克隆抗體，加底物顯色。顯色程度與特異性IgM抗體含量呈正相關(guān)，以待檢血清與特異性抗原和陰性血清（對照）與抗原反應(yīng)光密度（0D）值的比值，作為判定IgM抗體反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

A1.2材料

A1.2.1 96孔聚苯乙烯U型塑料板、酶標(biāo)儀。

A1.2.2 10～100μL可調(diào)加樣器1支、10 mL吸管若干。

A1.2.3抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體。

A1.2.4抗原

a） Cs/36細(xì)胞培養(yǎng)的各型DV為陽性抗原。

b）未接種病毒的正常CJ36細(xì)胞為陰性抗原對照。

（抗原制備：病毒接種CJ36細(xì)胞，病變達“+++”，凍融3次，用波長14～22 kHz超聲波粉碎3次，每次30 s.3 000 r/min離心15 min，上清即為抗原。

A1.2.5抗IgM陰性或陽性對照血清

A1.2.6辣根過氧化物酶標(biāo)化DVI～4型單克隆抗體。

A1.2.7緩沖液

a.洗液：O.05%吐溫-20 pH7.4PBS

b.稀釋液：10%牛血清 pH7.4PBS

c.封閉液：1%牛血清白蛋白 pH9.6碳酸緩沖液

A1.2.8底物：鄰苯二胺溶液（pH5.O磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液100mL，鄰苯二胺40 mg，30%過氧化氫溶液0.15 mL，臨用前按需配制，立即使用）。

A1.2.9終止液：1 mol/L硫酸。

A1.3檢測方法

A1.3.1用稀釋液按效價稀釋抗人μ鏈，每孔加0.1 mL，加蓋，4℃過夜。

A1.3.2棄去抗人μ鏈。用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.3棄封閉液。用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，加1：10待檢血清，每標(biāo)本加10孔，每孔0.1 mL，37℃水浴2h.

A1.3.4棄血清，用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，分別加4個型DV抗原及陰性抗原對照，按順序各加2孔至每份待檢血清的10個孔中，每孔0.1mL，4℃過夜。

A1.3.5棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的DF酶標(biāo)單克隆抗體，正常抗原加四個型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.6去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，每孔加入新鮮配制的底物液0.1mL，37℃水浴30 min，顯色。

A1.3.7每孔加1 mol/L硫酸溶液0.05mL，終止反應(yīng)。

A1.4結(jié)果判斷

A1.4.1 酶標(biāo)檢測儀測定OD值（空向?qū)φ照{(diào)零），見式（A1）。

k=（OD₁-OD₀）/（OD₂-OD₀）……………………………………（A1）

式中：OD₁——血清與病毒抗原反應(yīng)的OD值；

OD₀——空白孔的OD值；

OD₂——血清與正?？乖磻?yīng)的OD值。

K≥2.1判為陽性。

A1.4.2目測法。陽性抗原孔呈淡黃色，桔黃色或淺棕黃色，陰性抗原基本無色。

A1.5意義

IgM抗體陽性，表示患者新近感染DV，適用于DF早期診斷。

A2血凝抑制（HI）試驗檢測DF血凝抑制抗體

A2.1原理

DV有血凝索抗原，在適宜的pH條件下能凝集鵝、雞及綿羊紅細(xì)胞，引起紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被加入的特異抗體所抑制，稱之為血凝抑制試驗（HI）?？捎糜谘种瓶贵w的測定。

A2.2材料

A2.2.1 U型塑料板（96孔）。

A2.2.2 10～100 μL、100～1 000 μL可調(diào)加樣器、10 mL吸管。

A2.2.3 1～4型DV鼠腦蔗糖丙酮抗原或DV C6/36細(xì)胞抗原，抗原與同型抗體滴度應(yīng)大于與異型抗體交叉反應(yīng)2個滴度以上。

A2.2.4稀釋液，pH6.4磷酸緩沖液，用于稀釋鵝血球。

pH9.O硼酸緩沖鹽水，用于稀釋血凝素和血清。

A2.2.5鵝血球：于鵝翅下靜脈抽血，置于血球保存液混勻，用生理鹽水洗3次，最后以2 000 r/min離心15 min醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)整理，棄去上清，用pH6.4PBS稀釋至0.5%鵝血球懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?

A2.2.6待檢血清處理：用生理鹽水把血清稀釋成1： 10，置56℃水浴滅活30 min.用10倍蚤4℃丙酮處理2次，離心去上清，沉淀物真空干燥，加入pH9.O硼酸緩沖鹽水恢復(fù)到l：10濃度。4℃過夜。然后每管加入50%鵝血球0. 05 mL，37℃水浴30 min.離心沉淀取上清，即為1： 10處理血清。陰、陽性對照血清同方法處理。

A2.3檢測步驟

A2.3.1血凝素滴定

在塑料板上，每孔加pH9.0硼酸緩沖鹽水25 μL.各取1～4型DV抗原25 μL各置于第1孔，作倍比稀釋，最后一孔混勻后棄25 μL.然后于每孔補加pH9.O稀釋液25 μL，各加0.5%鵝血球50 μL混勻，置于37℃水浴作用2h，結(jié)果以最高稀釋度出現(xiàn)“++”為1個血凝單位，正式試驗用4個單位。

A2.3.2血凝抑制試驗

在塑料板中，除第1孔外，于各孔加入pH9.0硼酸緩沖鹽水25 μL.第1、2孔和第8孔分別加入25μL巳處理待檢血清，從第2孔開始，作倍比稀釋，最后一孔不稀釋，補加pH9.O硼酸緩沖鹽水25 μL.然后按順序予第1排至第4排各分別加入DV1～4型4個單位的血凝抗原25 μL.最后一孔不加抗原。混勻，放37℃水浴2h，再于每孔加0.5%鵝血球50μL，混勻，37℃水浴2h，觀察結(jié)果。

A2.4結(jié)果判斷

以完全抑制鵝血球凝集的血清最高稀釋度倒數(shù)為血凝抑制抗體效價。

A2.5意義

恢復(fù)期血清滴度比急性期血清滴度有4倍增高可確診。

A3補體結(jié)合（CF）試驗

A3.1原理

補體有結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物的特性。病毒抗原與特異性抗體（試驗材料）形成復(fù)合物時，加入一定量補體。則補體與之結(jié)合，不再以游離的形式存在，此時，加入另一對抗原，抗體（羊血球溶血索），由于后者沒有游離的補體參與反應(yīng)，結(jié)果不溶血，表示補體已結(jié)合于抗原-抗體復(fù)合物中，稱為陽性，如試驗材料中沒有病毒抗原一抗體復(fù)合物，則加入的定盤補體仍以游離的形式存在，與再加入的羊血球溶血索反應(yīng)而顯溶血，此為陰性。

A3.2材料及方法

（略）

A3.3意義

單份血清抗體滴度達1：32，對診斷登革熱有參考意義，恢復(fù)期血清比急性期血清抗體滴度有4倍抗體增長可確診。

A4用免疫熒光法（FA/IFA）檢測雙份血清IgG抗體

A4.1原理

某些熒光索（常用異硫氰酸熒光素）能與抗體蛋白分子結(jié)合，而不喪失抗體活力，仍能和相應(yīng)的抗原發(fā)生特異免疫反應(yīng)，產(chǎn)生免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物由于有熒光色素的參與，在熒光顯微鏡下顯示熒光，表明有特異性抗原存在。直接免疫熒光法可用于檢測感染細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原，間接免疫熒光法可查待檢血清中的特異性抗體。

A4.2材料

A4.2.1 10～100 μL，100～1 000 μL可調(diào)移液器各1支。

A4.2.2 DV1～4型抗原片（登革標(biāo)準(zhǔn)毒株感染Cs/36細(xì)胞制備，低溫干燥保存）及相應(yīng)單克隆抗體（陽性對照）、陰性血清。

A4.2.3羊抗人（兔抗人）IgG熒光抗體。

A4.2.4待檢患者血清（急性期和恢復(fù)期）。

A4.2.5常用稀釋液。pH7.2～7.4PBS、伊文斯蘭、封片膠等。

A4.2.6熒光顯微鏡。

A4.3檢測步驟

A4.3.1取出抗原片，冷風(fēng)吹干。

A4.3.2用pH7.2～7.4PBS稀釋待檢血清，從1：20開始，倍比稀釋至所需稀釋度。

A4.3.3用加樣器依次從商稀釋度向低稀釋度逐個加入稀釋的待檢血清于四個型的DV抗原片孔中，每型各加2孔待檢系列稀釋血清，血清最以完全覆蓋抗原面而不溢出孔外為準(zhǔn)，置濕盒內(nèi)，在37℃水浴孵育30 min（每次試驗同時作陰、陽性對照）。

A4.3.4用pH7.2～7. 4PBS洗滌3次，每次約30 s至1 min，再用蒸餾水洗1次，冷風(fēng)吹干。

A4.3.5用pHT.2～7.4PBS稀釋熒光抗體。使其內(nèi)含2個工作單位和1 ：8 000伊文斯蘭的熒光抗體，加入各孔中。使完全覆蓋抗原面-置濕盒中，37℃水浴作用30 min.取出，如A4.3.4洗滌及吹干。

A4.3.6用封片膠（或甘油緩沖液）封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

A4.4結(jié)果判斷

特異性熒光呈黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞漿中。根據(jù)熒光亮度和陽性細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占的比例可將熒光反應(yīng)大致區(qū)分為“+～++++”，無熒光者為“-”，檢測抗體滴度時，以特異熒光達“++”最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。

A4.5意義

陽性結(jié)果，表明提供血清的個體曾受到DV感染，大于1：80有診斷參考意義醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)整理?；謴?fù)期抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或以上升高則可確診。

A5免疫斑點（dengue blot）試驗檢測DV-IgG抗體

A5.1原理

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，把抗原固定于硝酸纖維索膜載體，與待測血清的特異性抗體結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)記物結(jié)合，通過酶與底物作用產(chǎn)生顏色，表示陽性，陰性不顯色。

A5.2材料及方法

（略）。

A5.5意義

陽性結(jié)果可作為DV感染參考。早期血清“-”，恢復(fù)期血清“+”確診DV感染。

A6 中和試驗（NT）

A6.1原理

使用對病毒敏感的動物、細(xì)胞或雞胚為材料，測定病毒受免疫血清中和殘存感染力與對照試驗組比較，計算出中和指數(shù)。

A6.2材料和方法

（略）

A6.3意義

中和指數(shù)在9以下為陰性，10～49為可疑，50以上為陽性。用于鑒定病毒和疾病診斷。