【關(guān)鍵詞】  白藜蘆醇；慶大霉素，自由基

　　Antifree radical activity of resveratrol in guinea pig cochlea

　　3Department of Otorhinolaryngology， Xijing Hospital，  Fourth Millitary Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】 AIM：  To study the prevention of gentamicin （GM） ototoxicity by resveratrol （Res） in guinea pig. METHODS：  Auditory brainstem response， cochlear preparation and transmission electron microscope were used to evaluate  the effects of hair cell on hearing threshold and the morphology of hair cell. Serum levels of GM was also tested. Guinea pigs were randomly assigned to 3 groups （GMtreated alone， GM and Res in combination and one control group）。 Serum levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） were also tested. RESULTS： MDA concentration in serum of the GM+Res group was significantly lower than that in the GM group （P<0.05）， while SOD level was much higher than that in the GM group （P<0.05）。 Res did not alter the serum level of GM. Morphological results were consistent with functional changes. The worst damages occurred in the basal circles. Damages in upper circles were lighter. GM mainly impaired the outer hair cells， on which Res had protective effect. CONCLUSION： Res may be a promising therapeutic agent to clean out free radical.

　　【Keywords】 resveratrol； gentamicins； free radical

　　【摘要】 目的：觀察白藜蘆醇（Res）的抗自由基作用。 方法：將豚鼠隨機(jī)分為3組：慶大霉素組（GM組）；Res＋GM組；空白對(duì)照組，每組動(dòng)物10只。 測(cè)定聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）、耳蝸鋪片、動(dòng)物血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量及GM血藥濃度，觀察Res對(duì)自由基的影響。 結(jié)果：GM+Res組血液中MDA較GM組明顯減少（P<0.05）；GM+Res組SOD活性明顯高于GM組（P<0.05）。  Res對(duì)GM的血藥濃度無(wú)影響。 耳蝸鋪片結(jié)果顯示空白對(duì)照組毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)損傷；GM組底圈毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重，向上逐漸減輕，與聽(tīng)閾升高的程度相平行。 而GM+Res組的毛細(xì)胞部分消失，與GM組比較損傷較輕。 結(jié)論：Res能對(duì)豚鼠體內(nèi)自由基含量產(chǎn)生很明顯的影響，對(duì)GM引起的耳毒性有保護(hù)作用。

　　【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇； 慶大霉素；自由基

　　0.引言

　　在氨基糖苷類藥物的耳毒性機(jī)制中，自由基是目前比較完善的學(xué)說(shuō)之一［1-2］。 在正常機(jī)體內(nèi)會(huì)有少量的自由基存在，病理狀態(tài)下，自由基含量會(huì)增加，直接造成細(xì)胞各成分損害，引起其代謝和功能障礙。 白藜蘆醇（resveratrol， Res）屬于非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于種子植物中。 結(jié)構(gòu)中有三個(gè)酚羥基，在機(jī)體中可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合自由基，從而減少自由基含量，達(dá)到清除自由基的作用。 中藥虎杖和葡萄皮中含有大量的Res，具有很大的藥用價(jià)值［3］。 丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是檢測(cè)自由基的重要參數(shù)。 我們將Res與慶大霉素（gentamicin， GM）用于動(dòng)物后通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物血清中MDA，SOD的含量以及觀察聽(tīng)性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response， ABR）和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化來(lái)研究Res對(duì)自由基的作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料

　　耳廓反射正常的健康雄性雜色豚鼠30只，體質(zhì)量250～350 g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；硫酸GM（西安高科陜西金方藥業(yè)公司）；Res（西安交大保賽生物技術(shù)股份有限公司）；MDA，SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.2方法

　　1.2.1動(dòng)物分組及處理

　　將30只豚鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。 ①GM組： 120 mg/kg皮下注射GM，1次/d，連續(xù)3 wk； ②Res＋GM組：用Res 375 mg/kg灌胃；GM 120 mg/kg皮下注射，1次/d，連續(xù)3 wk；③空白對(duì)照組：不給試驗(yàn)動(dòng)物任何藥物。 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間每天秤體質(zhì)量以調(diào)整用藥量。 用藥前及用藥后第1，3，4和6 wk檢測(cè)ABR，在用藥后第1，3 wk分別取血檢測(cè)血清中MDA，SOD含量及血清中GM含量；第4次測(cè)ABR后每組取2只豚鼠耳蝸，供光鏡觀察耳蝸鋪片。

　　1.2.2ABR反應(yīng)閾檢測(cè)

　　豚鼠的ABR 以Ⅲ波最為顯著。 動(dòng)物在戊巴比妥鈉40 mg/kg皮下注射麻醉后，將針型記錄電極置前額正中皮下，參考電極置測(cè)試耳外耳道口后上皮下，鼻尖接地。 用Biologic 聲刺激器，286計(jì)算機(jī)自動(dòng)采樣，采用短純音（tone burst，上升下降時(shí)間各2 ms，平臺(tái)時(shí)間1 ms） 1 kHz，8 kHz刺激，間隔75 ms，掃描時(shí)間20 ms，疊加256次，帶通濾波80～1500 Hz，在屏蔽隔聲室內(nèi)常規(guī)測(cè)試。

　　1.2.3耳蝸硬鋪片標(biāo)本制備［4］

　　將動(dòng)物麻醉致死，取出聽(tīng)泡暴露骨性耳蝸，于顯微鏡下在冰盒內(nèi)快速摘除鐙骨，刺破圓窗，挑開(kāi)蝸?lái)敚?用5～10 g/L AgNO3分別從蝸尖和蝸底圓窗反復(fù)灌注，完畢后將標(biāo)本浸入5～10 g/L AgNO3液體中，置4℃冰箱15～20 min，用 25 mL/L戊二醛固定灌注標(biāo)本，灌注方法同上，放入冰箱內(nèi)固定2～4 h，取出標(biāo)本在陽(yáng)光下曝光40～60 min使標(biāo)本由黃色變成黑色，再置于25 mL/ L戊二醛于4℃冰箱固定24 h，解剖顯微鏡下常規(guī)制備，分離各圈基底膜，甘油封片。

　　1.2.4檢測(cè)血清中MDA，SOD

　　用藥后19 d于各組動(dòng)物心肌取血。 離心，取血清-20℃凍存。 采用MDA，SOD試劑盒，按說(shuō)明操作檢測(cè)。

　　2.結(jié)果

　　實(shí)驗(yàn)中GM組2只動(dòng)物死亡，死前均消瘦、耳廓反射消失、無(wú)力。 GM+Res組有1只動(dòng)物死亡。 空白對(duì)照組無(wú)死亡。

　　2.1ABR檢測(cè)結(jié)果

　　用藥后各組動(dòng)物ABR出現(xiàn)閾移。 1  KHz ABR閾移：GM組（28.8±2.9）dB；Res＋GM組（5.2±2.9） dB ，兩組間差異顯著（P<0.01）。 8 kHz ABR閾移： GM組（40.3±3.7） dB； Res+GM組（12.4±2.2） dB，兩組間差異顯著（P<0.01）高頻聽(tīng)力損失比低頻重。

　　2.2用藥后兩組動(dòng)物的耳蝸鋪片比較

　　空白對(duì)照組耳蝸鋪片毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)缺失。 GM組底圈毛細(xì)胞損傷最重，底圈和第二圈外毛細(xì)胞損失嚴(yán)重，向上逐漸減輕，與聽(tīng)閾升高的程度相平行。 而Res＋GM組相對(duì)較輕。

　　2.3MDA含量和SOD活力

　　用藥1，3 wk時(shí)，Res+GM組血清的MDA含量均低于GM組，差異顯著（P<0.05）； GM組血清SOD活力均低于Res＋GM組（P<0.01）。

　　2.4腎功檢測(cè)結(jié)果

　　用藥1，3 wk時(shí)，Res + GM組血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）均明顯低于GM組（P<0.05，表1）。圖5白藜蘆醇組3 wk時(shí)毛細(xì)胞部分消失×400

　　2.5血清濃度組間血清GM濃度

　　無(wú)顯著差異（P>0.05）；Res對(duì)GM的血藥濃度無(wú)影響。

　　3.討論

　　近年來(lái)，天然藥物由于其毒副作用小，藥物來(lái)源范圍廣泛等原因，在新藥研制領(lǐng)域受到越來(lái)越多的重視和關(guān)注。 Res屬于非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于種子植物中。 Res的結(jié)構(gòu)中有三個(gè)酚羥基，在機(jī)體中可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合自由基，從而減少自由基含量，達(dá)到清除自由基的作用。 而氨基糖甙類抗生素的耳毒作用機(jī)制之一為自由基學(xué)說(shuō)。 此學(xué)說(shuō)認(rèn)為正常機(jī)體組織內(nèi)有少量的自由基存在，病理狀態(tài)下自由基含量會(huì)增加，其中以氧族羥基自由基為主，由于性質(zhì)不穩(wěn)定，氧化作用強(qiáng)，對(duì)膜結(jié)構(gòu)的攻擊最為嚴(yán)重，能引起膜脂質(zhì)氧化，通透性增加造成細(xì)胞死亡［5-6］。 我們的結(jié)果顯示Res與GM同時(shí)使用具有保護(hù)GM所致耳蝸損傷時(shí)耳蝸的SOD活性作用， 增強(qiáng)了內(nèi)源性氧自由基清除酶的功能， 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)， 減少氧自由基的代謝產(chǎn)物MDA， 從而保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞： 試驗(yàn)有Res+GM組和GM組的聽(tīng)閾有明顯差異，SOD 和MDA的數(shù)據(jù)顯示，Res+GM組和GM組有明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 耳蝸鋪片照片顯示：GM組的毛細(xì)胞損傷情況比Res+GM組嚴(yán)重。 Res+GM組對(duì)耳蝸毛細(xì)胞有保護(hù)作用。 腎功檢測(cè)結(jié)果也顯示Res 對(duì)GM的腎毒性有保護(hù)作用，由以上結(jié)果可看出Res是一種有效的自由基清除劑并且對(duì)GM的毒性有抑制作用。 但是否具有直接清除氧自由基的作用，還有待于進(jìn)一步研究。

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